Лабораторная диагностика атипичной пневмонии sars методом пцр

Èíñòðóêöèÿ №6 îò 03.05.2003

ÌÈÍÈÑÒÅÐÑÒÂÎ ÇÄÐÀÂÎÎÕÐÀÍÅÍÈß ÐÎÑÑÈÉÑÊÎÉ ÔÅÄÅÐÀÖÈÈ

Àííîòàöèÿ

 íàñòîÿùèõ ìåòîäè÷åñêèõ ðåêîìåíäàöèÿõ ïðèâîäÿòñÿ ïðàâèëà îðãàíèçàöèè è âûïîëíåíèÿ ãåíîäèàãíîñòè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé ïðè ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêå ñèíäðîìà îñòðîãî ðåñïèðàòîðíîãî çàáîëåâàíèÿ (àòèïè÷íîé ïíåâìîíèè — SARS). Ðåêîìåíäàöèè ïðåäíàçíà÷åíû äëÿ ñïåöèàëèñòîâ íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèõ ïðîòèâî÷óìíûõ èíñòèòóòîâ, ïðîòèâî÷óìíûõ ñòàíöèé è äðóãèõ ó÷ðåæäåíèé, ïðèìåíÿþùèõ ìåòîä ÏÖÐ äëÿ îáíàðóæåíèÿ ÄÍÊ âîçáóäèòåëåé èíôåêöèîííûõ çàáîëåâàíèé I-II ãðóïï ïàòîãåííîñòè.

ÐÀÇÐÀÁÎÒÀÍÛ:
Ìèíèñòåðñòâîì çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè (Ôåäîðîâ Þ.Ì., Æèëèíà Í.ß.)
Ðîññèéñêèì ÍÈÏ×È «Ìèêðîá» (Êóòûðåâ Â.Â., Êóëè÷åíêî À.Í., Äðîçäîâ È.Ã., Øàðîâà È.Í., Îñèíà Í.À., Ãàðàíèíà Ñ.Á., Ëÿïèí Ì.Í.)
Âèðóñîëîãè÷åñêèì öåíòðîì ÍÈÈ ìèêðîáèîëîãèè Ìèíîáîðîíû Ðîññèè (Ìàêñèìîâ Â.À., Ìàðêîâ Â.Í.)
ÃÍÖ âèðóñîëîãèè è áèîòåõíîëîãèè «Âåêòîð»(Òåðíîâîé Â.À., Ðóäçåâè÷ Ò.Í., Ìàêñèìîâ Í.Ë., Èãíàòüåâ Ã.Ì., Íåòåñîâ Ñ.Â.)

1.Ââåäåíèå

1.1. Íàñòîÿùèå ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè îïðåäåëÿþò âðåìåííûé ïîðÿäîê è ïðàâèëà ïðîâåäåíèÿ ëàáîðàòîðíûõ èññëåäîâàíèé ïî ñïåöèôè÷åñêîé äåòåêöèè ÐÍÊ êîðîíàâèðóñîâ, âûçûâàþùèõ ñèíäðîì îñòðîãî ðåñïèðàòîðíîãî çàáîëåâàíèÿ, èëè àòèïè÷íóþ ïíåâìîíèþ, èëè SARS (äàëåå ïî òåêñòó SARS) äî çàâåðøåíèÿ ðàçðàáîòêè è âíåäðåíèÿ â ïðàêòèêó äèàãíîñòè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ ê âèðóñó SARS.
1.2. Ðåêîìåíäàöèè ðàçðàáîòàíû äëÿ ñïåöèàëèñòîâ ïðîòèâî÷óìíûõ èíñòèòóòîâ, ïðîòèâî÷óìíûõ ñòàíöèé è äðóãèõ ó÷ðåæäåíèé, îñóùåñòâëÿþùèõ ëàáîðàòîðíóþ äèàãíîñòèêó SARS, â ñîîòâåòñòâèè ñ «Âðåìåííîé èíñòðóêöèåé ïî ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêå ñèíäðîìà îñòðîãî ðåñïèðàòîðíîãî çàáîëåâàíèÿ (àòèïè÷íîé ïíåâìîíèè) (SARS)» (ïèñüìî Ïåðâîãî çàìåñòèòåëÿ Ìèíèñòðà çäðàâîîõðàíåíèÿ Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè îò 21.04.03 ã.).
1.3. Èíêóáàöèîííûé ïåðèîä SARS ñîñòàâëÿåò 2-14 ñóòîê, â ñðåäíåì 7-10 ñóòîê, ëèõîðàäî÷íûé ïåðèîä – äî 10-14 ñóòîê. ÐÍÊ âèðóñà ìåòîäîì ÏÖÐ âûÿâëÿþò â áèîëîãè÷åñêèõ æèäêîñòÿõ: êðîâè, ìîêðîòå, ñìûâàõ íîñîãëîòêè íà 1-10 ñóòêè çàáîëåâàíèÿ.
1.4.  ñâÿçè ñ ñóùåñòâåííûìè òðóäíîñòÿìè â êóëüòèâèðîâàíèè è âûäåëåíèè êîðîíàâèðóñîâ, ìåòîäû ãåíîäèàãíîñòèêè ÿâëÿþòñÿ â íàñòîÿùåå âðåìÿ âåäóùèìè â ïîäòâåðæäåíèè ñâÿçè çàáîëåâàíèÿ «àòèïè÷íîé ïíåâìîíèåé» ñ âèðóñîì SARS. Ïðèíöèï ìåòîäà ñîñòîèò â íàïðàâëåííîé àìïëèôèêàöèè êÄÍÊ, ñèíòåçèðóåìîé ñ ïîìîùüþ îáðàòíîé òðàíñêðèïòàçû, íà îñíîâå ñïåöèôè÷íîãî ôðàãìåíòà ÐÍÊ âèðóñà. Ñ öåëüþ ïîâûøåíèÿ äîñòîâåðíîñòè àíàëèçà ðåêîìåíäóåòñÿ ïðîâåäåíèå ÏÖÐ ñ äâóìÿ ïàðàìè ïðàéìåðîâ (èñïîëüçóþòñÿ ðàçäåëüíî).
1.5.  ìåòîäè÷åñêèõ ðåêîìåíäàöèÿõ ïðåäñòàâëåíû ïðîòîêîëû ÏÖÐ, îñíîâàííûå íà ðåêîìåíäàöèÿõ ÂÎÇ, äî ïîÿâëåíèÿ ïåðâûõ ñëó÷àÿõ çàáîëåâàíèé «àòèïè÷íîé ïíåâìîíèè» â Ðîññèè. Ïðîòîêîëû ìîãóò áûòü ìîäèôèöèðîâàíû â äàëüíåéøåì, ïî ìåðå èçìåíåíèÿ ñèòóàöèè.
1.6.  ñîîòâåòñòâèè ñ «Âðåìåííîé èíñòðóêöèåé …» âèðóñ SARS îòíåñ¸í ê II ãðóïïå ïàòîãåííîñòè. Ñ ó÷¸òîì îòñóòñòâèÿ ðåãëàìåíòèðîâàííûõ ìåòîäîâ èíàêòèâàöèè âèðóñîâ ïðè èññëåäîâàíèÿõ ïðîâîäèìûõ ìåòîäîì ÏÖÐ è äîêàçàííîé âûñîêîé îïàñíîñòè çàðàæåíèÿ ìåäèöèíñêîãî ïåðñîíàëà âñÿ ðàáîòà ïðîâîäèòñÿ ñ òùàòåëüíûì ñîáëþäåíèåì ìåð áèîáåçîïàñíîñòè ðåãëàìåíòèðîâàííûõ ÑÏ 1.2.011-94 «Áåçîïàñíîñòü ðàáîòû ñ ìèêðîîðãàíèçìàìè I-II ãðóïï ïàòîãåííîñòè» è ÑÏ 1.2.036-95 «Ïîðÿäîê ó÷åòà, õðàíåíèÿ, ïåðåäà÷è è òðàíñïîðòèðîâàíèÿ ìèêðîîðãàíèçìîâ I-IV ãðóïï ïàòîãåííîñòè».

2. Îòáîð ïðîá è òðàíñïîðòèðîâêà áèîëîãè÷åñêîãî ìàòåðèàëà

2.1. Îòáîð ïðîá îò áîëüíûõ è ïîäîçðèòåëüíûõ íà çàðàæåíèå âèðóñîì SARS îñóùåñòâëÿåò ìåäèöèíñêèé ïåðñîíàë, ñ ñîáëþäåíèåì ïðàâèë ïðîòèâîýïèäåìè÷åñêîãî ðåæèìà.
2.2. Ìàòåðèàë äëÿ èññëåäîâàíèÿ ìåòîäîì ÏÖÐ çàáèðàþò â ñòåðèëüíûå ïðîáèðêè ñ ãåðìåòè÷íî çàâèí÷èâàþùèìèñÿ êðûøêàìè. Êîíñåðâàíò (ìåðòèîëÿò íàòðèÿ) íå äîáàâëÿåòñÿ.
2.2.1. Êðîâü. Çàáîð ïðîèçâîäÿò èç ëîêòåâîé âåíû â êîëè÷åñòâå 4,5 ìë ñòåðèëüíûì øïðèöåì, â êîòîðûé ïðåäâàðèòåëüíî âíîñÿò 0,5 ìë ñòåðèëüíîãî 4 % ðàñòâîðà íàòðèÿ öèòðàòà è ïåðåíîñÿò â ïðîáèðêó. Àêêóðàòíî ïåðåìåøèâàþò ïîêà÷èâàíèåì.
2.2.2. Ìàçêè è ñìûâû ñ íîñîãëîòêè, áðîíõîàëüâåîëÿðíûå ñìûâû, ïëåâðàëüíóþ æèäêîñòü îòáèðàþò â êîëè÷åñòâå 5 ìë. Ìàçêè çàáèðàþò òàìïîíàìè è ïîìåùàþò â ñòåðèëüíûå ïðîáèðêè ñ 5 ìë ôèçèîëîãè÷åñêîãî ðàñòâîðà. Íå ðåêîìåíäóåòñÿ èñïîëüçîâàòü òàìïîíû íà äåðåâÿííîé ïàëî÷êå, òàê êàê îíè ìîãóò ñîäåðæàòü ñóáñòðàòû èíàêòèâèðóþùèå âèðóñû è èíãèáèðóþùèå ÏÖÐ.
2.2.3. Ñåêöèîííûé ìàòåðèàë. Èññëåäóþò ë¸ãêèå, ñåãìåíòàðíûå áðîíõè, êðîâü, ïå÷åíü, ñåëåç¸íêó. Êóñî÷êè îðãàíîâ âåñîì 5-10 ã ïîìåùàþò â ñòåðèëüíûå ãåðìåòè÷íî çàêðûâàþùèåñÿ ¸ìêîñòè.
2.2.5. Êðîâü, ñìûâû ñ äûõàòåëüíûõ ïóòåé õðàíÿò è òðàíñïîðòèðóþò â ëàáîðàòîðèþ äëÿ èññëåäîâàíèé ïðè òåìïåðàòóðå ìèíóñ 20° Ñ.

3. Îðãàíèçàöèÿ ðàáîò ïðè ïðîâåäåíèè èññëåäîâàíèé ñ èñïîëüçîâàíèåì ÏÖÐ

3.1. Èññëåäîâàíèÿ ìàòåðèàëà îò áîëüíîãî ïîäîçðèòåëüíîãî íà çàðàæ¸ííîñòü âèðóñîì SARS ìåòîäîì ÏÖÐ ïðîâîäÿò â ó÷ðåæäåíèÿõ, èìåþùèõ ðàçðåøåíèå íà ðàáîòó ñ ÏÁÀ I-II ãðóïï ïàòîãåííîñòè.
3.2. Äëÿ ïðîâåäåíèÿ ãåíîäèàãíîñòè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé âûäåëÿþò ÷åòûðå îòäåëüíûå êîìíàòû, ïðåäíàçíà÷åííûå äëÿ âûïîëíåíèÿ ñëåäóþùèõ ýòàïîâ ÏÖÐ-àíàëèçà:
à — ïåðâè÷íàÿ ïîäãîòîâêà, âûäåëåíèå ÐÍÊ è ïîñòàíîâêà ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè (ñèíòåç êÄÍÊ);
á – ïðîâåäåíèå ÏÖÐ;
â — ó÷åò ðåçóëüòàòîâ ðåàêöèè àìïëèôèêàöèè;
ã — ïðèãîòîâëåíèå ðåàêöèîííûõ ñìåñåé äëÿ ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè è ÏÖÐ (÷èñòîå ïîìåùåíèå).
Êîìíàòû «à», «á», «â» óêîìïëåêòîâûâàþòñÿ åìêîñòÿìè ñ äåçèíôèöèðóþùèì ñðåäñòâîì è áàêàìè äëÿ àâòîêëàâèðîâàíèÿ.
3.3. Ïîìåùåíèå «à» äîëæíî áûòü îáîðóäîâàíî áîêñèðóþùèì óñòðîéñòâîì (áîêñîì áåçîïàñíîñòè).  áîêñå ðàçìåùàþò ïîääîí ñ ñàëôåòêîé, ñìî÷åííîé 6% ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà, äëÿ ðàçáîðà è ïåðâè÷íîé ïîäãîòîâêè ïðîá, îáîðóäîâàíèå äëÿ âûäåëåíèÿ ÐÍÊ è ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè: ìèêðîöåíòðèôóãó, âîðòåêñ, òâåðäîòåëüíûé òåðìîñòàò.  ýòîé êîìíàòå íàõîäèòñÿ íèçêîòåìïåðàòóðíûé õîëîäèëüíèê äëÿ õðàíåíèÿ íàòèâíîãî ìàòåðèàëà.  ïîìåùåíèè «á» ðàñïîëîæåí àìïëèôèêàòîð äëÿ ïîñòàíîâêè ÏÖÐ.  ïîìåùåíèè «â» íàõîäèòñÿ îáîðóäîâàíèå äëÿ ïðîâåäåíèÿ ýëåêòðîôîðåçà, ó÷åòà è äîêóìåíòèðîâàíèÿ ðåçóëüòàòîâ (èñòî÷íèê òîêà, êàìåðà äëÿ ýëåêòðîôîðåçà, òðàíñèëëþìèíàòîð ñ óñòðîéñòâîì äëÿ äîêóìåíòèðîâàíèÿ ðåçóëüòàòîâ ýëåêòðîôîðåçà è ïîääîí ñ ñàëôåòêîé, ñìî÷åííîé 6 % ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà.
3.4. Ïîäãîòîâêó ðåàêöèîííûõ ñìåñåé (master mix) äëÿ ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè è ÏÖÐ îñóùåñòâëÿþò â îòäåëüíîì «÷èñòîì» ïîìåùåíèè «ã». Ïðîáèðêè ñ ïðèãîòîâëåííûìè ðåàêòèâàìè ïåðåäàþò â êîìíàòû «à» è «á» äëÿ âíåñåíèÿ â íèõ èññëåäóåìûõ ïðîá.
3.5. Êàæäîå ïîìåùåíèå äîëæíî èìåòü ñâîé íàáîð, àâòîìàòè÷åñêèõ ïèïåòîê, íàêîíå÷íèêîâ (ñ ôèëüòðàìè), ïëàñòèêîâîé è ñòåêëÿííîé ïîñóäû, èñïîëüçóåìûõ òîëüêî â äàííîé êîìíàòå (áîêñå) è èìåþùèõ ñîîòâåòñòâóþùóþ ìàðêèðîâêó. Íàêîíå÷íèêè äîëæíû ñòðîãî ñîîòâåòñòâîâàòü àâòîìàòè÷åñêèì ïèïåòêàì, ïðîáèðêè äëÿ àìïëèôèêàöèè — òåðìîöèêëåðàì (â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé ôèðìû-ïðîèçâîäèòåëÿ ïðèáîðà).
3.6. Àïòå÷êà äîïîëíèòåëüíî êîìïëåêòóåòñÿ: 1% ðàñòâîðîì áîðíîé êèñëîòû, èíòåðôåðîíîì.

4. Ðåêîìåíäóåìûå íàáîðû ðåàêòèâîâ, îáîðóäîâàíèå è ðàñõîäíûå ìàòåðèàëû.

4.1. Íàáîðû ðåàêòèâîâ.
— íàáîð äëÿ âûäåëåíèÿ ÐÍÊ «Ðèáî-ñîðá» (ïðîèçâîäñòâî ÖÍÈÈ ýïèäåìèîëîãèè, ã. Ìîñêâà);
— íàáîð äëÿ ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè «Ðåâåðòà»; (ïðîèçâîäñòâî ÖÍÈÈ ýïèäåìèîëîãèè, ã. Ìîñêâà);
— îëèãîíóêëåîòèäíûå ïðàéìåðû (ñèíòåç îñóùåñòâëÿåò ÎÎÎ «Ñèíòîë» ã.Ìîñêâà);
— ìàðêåðû ìîëåêóëÿðíîãî âåñà (ïðîèçâîäñòâî ÎÎΫÑèíòîë» ã.Ìîñêâà)
4.2. Îáîðóäîâàíèå è ðàñõîäíûå ìàòåðèàëû äëÿ ÏÖÐ (ìîãóò áûòü çàìåíåíû íà àíàëîãè÷íûå ïî ñâîèì õàðàêòåðèñòèêàì)
— àìïëèôèêàòîð (ïðîãðàììèðóåìûé òåðìîöèêëåð) Òåðöèêòì ÌÑ 2 (ÇÀÎ «ÄÍÊ-òåõíîëîãèÿ», Ðîññèÿ);
— ìàëîãàáàðèòíàÿ âûñîêîñêîðîñòíàÿ ëàáîðàòîðíàÿ ìèêðîöåíòðèôóãà «ÖèêëîÒåìï – 201», 16000 îá/ìèí, ñî ñìåííûìè ðîòîðàìè äëÿ ïðîáèðîê – 0,5 ìë è 1,5/2,0 ìë ( ÍÏÔ «ÑÒÌ-Ö», Ðîññèÿ);
— ìèêðîöåíòðèôóãà/âñòðÿõèâàòåëü ÒÝÒÀ 2 (ÎÎÎ «Áèîêîì», Ðîññèÿ);
— ïðîãðàììèðóåìûé òâåðäîòåëüíûé òåðìîñòàò Ò-2415 ñ äèàïàçîíîì ðàáî÷èõ òåìïåðàòóð îò 20° Ñ äî 120° Ñ (ÎÎÎ «Áèîêîì», Ðîññèÿ);
— àâòîìàòè÷åñêèå ïèïåòêè «Ëåíïèïåò» Ðîññèÿ 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 ìêë;
— ïðîãðàììèðóåìûé îõëàäèòåëü ïðîá ÎÏ-01 äëÿ ïðîáèðîê 0,5 è 1,5 ìë (ÎÎÎ «Áèîêîì», Ðîññèÿ);
— èñòî÷íèê òîêà «Ýëüô-4» (ÇÀÎ «ÄÍÊ-òåõíîëîãèÿ», Ðîññèÿ);
— ìèíèêàìåðà äëÿ ýëåêòðîôîðåçà SE-1 (ÎÎÎ «Õåëèêîí», Ðîññèÿ);
— ÓÔ òðàíñèëëþìèíàòîð LKB 2011 (&quotLKB&quot, Øâåöèÿ);
— ôîòîàïïàðàò ñ îðàíæåâûì èëè èíòåðôåðåíöèàëüíûì (594 íì) ñôåòîôèëüòðîì èëè âèäèîñèñòåìà äëÿ êîìïüþòîðíîãî äîêóìåíòèðîâàíèÿ;
— ìèêðîöåòðèôóæíûå ïðîáèðêè îáúåìîì 0,6 ìë (QSP, ÑØÀ);
— ìèêðîöåíòðèôóæíûå ïðîáèðêè îáúåìîì 1,5 ìë ñ çàâèí÷èâàþùåéñÿ êðûøêîé);
— íàêîíå÷íèêè äëÿ àâòîìàòè÷åñêèõ ïèïåòîê ñ ôèëüòðàìè íà 10, 200 è 1000 ìêë (QSP, ÑØÀ).

5. Ïðîâåäåíèå àíàëèçà

5.1. Ïåðâè÷íàÿ ïîäãîòîâêà ïðîá.
Êîíòåéíåð (ãåðìåòè÷íóþ òàðó, áèêñ) ñ äîñòàâëåííûìè íà èññëåäîâàíèÿ ïðîáàìè óñòàíàâëèâàþò â ïîääîí, â áîêñ áåçîïàñíîñòè íà 35-40 ìèí. Çàòåì îñòîðîæíî îòêðûâàþò êðûøêó êîíòåéíåðà è, óáåäèâøèñü â öåëîñòíîñòè åìêîñòè(åé) ñ ìàòåðèàëîì, âûñòàâëÿþò èõ íà ïîääîí ïðåäâàðèòåëüíî îáðàáîòàâ ñíàðóæè äåçðàñòâîðîì. Åìêîñòè ìàðêèðóþò è ðåãèñòðèðóþò (ëèñò ðåãèñòðàöèè âûíîñÿò èç «çàðàçíîé&raquo çîíû òîëüêî ïîñëå îáðàáîòêè ïîãðóæåíèåì â äåçèíôèöèðóþùèé ðàñòâîð).
5.2. Âûäåëåíèå ÐÍÊ
 ìèêðîöåíòðèôóæíûå ïðîáèðêè ñ çàâèí÷èâàþùåéñÿ êðûøêîé, ñîäåðæàùèå 450 ìêë ëèçèðóþùåãî áóôåðà 1, âíîñÿò ïî 100 ìêë èññëåäóåìûõ ïðîá, ïåðåìåøèâàþò è èíêóáèðóþò ïðè 65° Ñ â òå÷åíèå 10 ìèí íà òâåðäîòåëüíîì òåðìîñòàòå. Îñòàâøèéñÿ ìàòåðèàë ïîìåùàþò â õîëîäèëüíèê íà ìèíóñ 20° Ñ äëÿ õðàíåíèÿ. Èñïîëüçîâàííûå ïðîáèðêè è íàêîíå÷íèêè, ñóïåðíàòàíò ïîìåùàþò â åìêîñòü, çàïîëíåííóþ íà 1/3 îáúåìà 0,1 N ðàñòâîðîì ãèäðîîêèñè íàòðèÿ.
Çàòåì â ïðîáèðêó âíîñÿò 30 ìêë íóêëåîñîðáåíòà, ïåðèîäè÷åñêè âñòðÿõèâàþò íà âîðòåêñå (ìèêðîöåíòðèôóãå/âñòðÿõèâàòåëå) â òå÷åíèå 5 ìèí. Ïîñëå ýòîãî öåíòðèôóãèðóþò ïðè 8000 g â òå÷åíèå 30 ñåê., ñóïåðíàòàíò óäàëÿþò , à ê îñàäêó äîáàâëÿþò 300 ìêë áóôåðà 2.
Ñîäåðæèìîå ïðîáèðêè âíîâü ïåðåìåøèâàþò íà âîðòåêñå äî ãîìîãåííîãî ñîñòîÿíèÿ, öåíòðèôóãèðóþò ïðè 8000 g â òå÷åíèå 30 ñåê., ñóïåðíàòàíò îòáèðàþò, à ê îñàäêó äîáàâëÿþò áóôåð 3. Îñàäîê ðåñóñïåíäèðóþò íà âîðòåêñå è öåíòðèôóãèðóþò ïðè 8000 g â òå÷åíèå 1 ìèí. Ñóïåðíàòàíò óäàëÿþò, ê îñàäêó äîáàâëÿþò 500 ìêë áóôåðà 4. Ñîäåðæèìîå ïåðåìåøèâàþò íà âîðòåêñå, çàòåì öåíòðèôóãèðóþò ïðè 8000 g â òå÷åíèå 30 ñåê, ñóïåðíàòàíò óäàëÿþò.
Îñàäîê âûñóøèâàþò ïðè òåìïåðàòóðå 65° Ñ â òå÷åíèå 5-7 ìèí. Ê îñàäêó äîáàâëÿþò 30 ìêë äåèîíèçîâàííîé ñòåðèëüíîé âîäû è âûäåðæèâàþò ïðè òåìïåðàòóðå 65° Ñ â òå÷åíèå 10 ìèí, ïåðèîäè÷åñêè âñòðÿõèâàÿ íà âîðòåêñå. Ïî îêîí÷àíèè âçâåñü öåíòðèôóãèðóþò ïðè 8000 g â òå÷åíèå 1 ìèí; 10 ìêë ñóïåðíàòàíòà èñïîëüçóþò äëÿ ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè.
5.3. Ïðîâåäåíèå ðåàêöèè îáðàòíîé òðàíñêðèïöèè
Îáðàòíóþ òðàíñêðèïöèþ ÐÍÊ ïðîâîäÿò ñ èñïîëüçîâàíèåì íàáîðà «Ðåâåðòà», îáåñïå÷èâàþùåãî ñèíòåç êîìëåìåíòàðíîé ÄÍÊ (êÄÍÊ), â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé ôèðìû-èçãîòîâèòåëÿ. Ïðîáèðêè ñ ðåàêöèîííîé ñìåñüþ, â êîëè÷åñòâå ñîîòâåòñòâóþùèì ÷èñëó ïðîá, ïåðåíîñÿò â êîìíàòó «à», ãäå âíîñÿò ïî 10 ìêë êàæäîé ïðîáû ýêñòðàãèðîâàííîé ÐÍÊ, àêêóðàòíî ïåðåìåøèâàþò, èíêóáèðóþò ïðè 37° Ñ â òå÷åíèå 30 ìèí.
5.4. Ïîñòàíîâêà ÏÖÐ
Äëÿ ïðîâåäåíèÿ ÏÖÐ èñïîëüçóþò äâå ïàðû ïðàéìåðîâ, îáåñïå÷èâàþùèå àìïëèôèêàöèþ ôðàãìåíòîâ ãåíà ÐÍÊ-çàâèñèìîé ÐÍÊ-ïîëèìåðàçû:
1) CDC1- 5’ – gggttgggactatcctaagtgtga – 3’, CDC2- 5’- ccatcatcagatagaatcatcata – 3′, ðàçìåð àìïëèêîíîâ 440 ï.í. (CDC, 2003);
2) SAR1s- 5’ – cctctcttgttcttgctcgca – 3’, SAR1as- 5’ – tatagtgagccgccacacatg – 3’, ðàçìåð àìïëèêîíîâ 121 ï.í. (Drosten C., et al. 2003).
ÏÖÐ ñ êàæäîé ïàðîé ïðàéìåðîâ ïðîâîäÿò â äâóõ îòäåëüíûõ ïðîáèðêàõ.
Ãîòîâÿò íåîáõîäèìîå êîëè÷åñòâî ìèêðîïðîáèðîê îáúåìîì 0,6 ìë, ïî 2 ïðîáèðêè íà êàæäóþ ïðîáó è îäíó – äëÿ îòðèöàòåëüíîãî êîíòðîëÿ, íóìåðóþò èõ. Ðåàêòèâû äëÿ ïîñòàíîâêè ÏÖÐ ïîëíîñòüþ ðàçìîðàæèâàþò è ïåðåìåøèâàþò íà âîðòåêñå â òå÷åíèå 10 ñåê. Ïðåäâàðèòåëüíî â ïîìåùåíèè «ã» ãîòîâÿò îáùóþ ðåàêöèîííóþ ñìåñü, èñõîäÿ èç òîãî, ÷òî íà îäíó ðåàêöèþ íåîáõîäèìî: Í2Î – 14,8 ìêë; 2,5 ìêë 10 Õ Á (0,7 ìÌ Òðèñ, 0,2 ìÌ (NH4)2SO4, 0,1 % Òâèí 20, 200 ìêã/ìë ÁÑÀ, ðÍ 8,5); 2,5 ìêë äÍÒÔ (2 ìÌ ðàñòâîð äÀÒÔ, äÃÒÔ, äÖÒÔ, äÒÒÔ); 1,0 ìêë 50 ìÌ ðàñòâîðà MgCl2, ïî 1 ìêë êàæäîãî ïðàéìåðà ñ êîíöåíòðàöèåé 12 ïìîëü/ìêë, 0,2 ìêë ôåðìåíòà Taq-ïîëèìåðàçû ñ êîíöåíòðàöèåé 5 åä/ìêë. Òùàòåëüíî ïåðåìåøèâàþò íà âîðòåêñå è ïåðåíîñÿò âî âñå ïðîáèðêè ïî 23 ìêë. Íàñëàèâàþò íà ïîâåðõíîñòü ïî 25-30 ìêë ìèíåðàëüíîãî ìàñëà.
Ïðîáèðêè ïåðåíîñÿò â ïîìåùåíèå «á» è âî âñå, êðîìå êîíòðîëüíîé, âíîñÿò ïîä ìàñëî ïî 2 ìêë ïîëó÷åííîé êÄÍÊ.  ïðîáèðêó, ïîìå÷åííóþ êàê îòðèöàòåëüíûé êîíòðîëü, âíîñÿò 2 ìêë äåèîíèçîâàííîé âîäû. Ïðè íàëè÷èè ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ â ñîîòâåòñòâóþùóþ ïðîáèðêó äîáàâëÿþò 2 ìêë ïîëîæèòåëüíîé êÄÍÊ. Ïðîáèðêè ïîìåùàþò â ïðîãðàììèðóåìûé òåðìîöèêëåð è ïðîâîäÿò àìïëèôèêàöèþ ïî ñëåäóþùåé ïðîãðàììå:
95° Ñ — 3 ìèí;
10 öèêëîâ
94° Ñ – 10 ñåê,
60° Ñ – 10 ñåê, (ñ ïîíèæåíèåì êàæäûé ñëåäóþùèé öèêë íà 1° Ñ)
72° Ñ – 30 ñåê;
40 öèêëîâ
94° Ñ – 10 ñåê,
56° Ñ – 10 ñåê,
72° Ñ – 30 ñåê;
72° C — 7 ìèí.
Ïîëó÷åííûå îáðàçöû õðàíÿò ïðè òåìïåðàòóðå 4° Ñ.
Ïîñëå çàâåðøåíèÿ ïðîãðàììû àìïëèôèêàöèè ïðîáèðêè ïåðåñòàâëÿþò èç ïðèáîðà â øòàòèâ, êîòîðûé ïîìåùàåò â êîíòåéíåð äëÿ òðàíñïîðòèðîâêè. Êîíòåéíåð îáðàáàòûâàåò ñíàðóæè äåçñðåäñòâîì è ïåðåäàþò äëÿ ïåðåíîñà â êîìíàòó «â».

5.5. Ó÷åò ðåçóëüòàòîâ.
 êîìíàòå «â» øòàòèâ ñ ïðîáèðêàìè ïîìåùàþò íà ïîääîí. Äëÿ ó÷åòà ðåçóëüòàòîâ èñïîëüçóþò ýëåêòðîôîðåç â 2,5 % àãàðîçíîì ãåëå. Ê ïðîäóêòàì àìïëèôèêàöèè ñ ïîìîùüþ àâòîìàòè÷åñêîé ïèïåòêè äîáàâëÿþò 1 ìêë áóôåðà äëÿ íàíåñåíèÿ ïðîá (0,25 % áðîìôåíîëîâûé ñèíèé, 15 % ôèêîëë 400 íà äèñòèëëèðîâàííîé âîäå), òùàòåëüíî ïåðåìåøèâàþò ïèïåòèðîâàíèåì è ïî 10 ìêë âíîñÿò â ëóíêè ãåëÿ. Èñïîëüçîâàííûå íàêîíå÷íèêè ïîìåùàþò â åìêîñòü.
Ïðè îòñóòñòâèè ïîëîæèòåëüíîãî êîíòðîëÿ â ëóíêó ãåëÿ âíîñÿò ìàðêåð ìîëåêóëÿðíîãî âåñà ÄÍÊ ñ øàãîì 50 èëè 100 ï.í., íàïðèìåð ÔÕ 174 DNA/BsuRI (HaeIII) MBI Fermentas, USA). Ïîñëå ÷åãî ãåëü ïåðåíîñÿò â êàìåðó äëÿ ýëåêòðîôîðåçà, çàïîëíåííóþ 1ÕÒÀÅ áóôåðîì (Òðèñ — 4,84 ã., ëåäÿíàÿ óêñóñíàÿ êèñëîòà — 1.16 ìë, 0,5 Ì ðàñòâîð ÝÄÒÀ, ðÍ 8,0 — 4 ìë). Çàêðûâàþò êðûøêó àïïàðàòà è âêëþ÷àþò åãî â ýëåêòðîñåòü ÷åðåç áëîê ïèòàíèÿ.
Ýëåêòðîôîðåç ïðîâîäÿò â ñîîòâåòñòâèè ñ èíñòðóêöèåé ïî ýêñïëóàòàöèè ïðèáîðà â òå÷åíèå 1-1,5 ÷, ïðè ãðàäèåíòå íàïðÿæåíèÿ 10 Â/ñì, ïîêà êðàñèòåëþ îñòàíåòñÿ ïðîéòè äî àíîäíîãî êðàÿ ãåëÿ 2 – 1,5 ñì. Îêðàøåííóþ áðîìèäîì ýòèäèÿ â õîäå ýëåêòðîôîðåçà ÄÍÊ â ãåëå âèçóàëèçèðóþò ïîä óëüòðàôèîëåòîâûì îñâåùåíèåì, äëÿ ÷åãî èñïîëüçóþò òðàíñèëëþìèíàòîð.  ñëó÷àå ïîÿâëåíèÿ â òðåêàõ, ñîîòâåòñòâóþùèõ èññëåäóåìûì îáðàçöàì ñâåòÿùèõñÿ ïîëîñ èõ ðàçìåð îïðåäåëÿþò îòíîñèòåëüíî ìàðêåðà ìîëåêóëÿðíîãî âåñà ÄÍÊ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ïðàéìåðîâ SARS1s è SARS1as ïðè ïîëîæèòåëüíîé ðåàêöèè ðàçìåð àìïëèêîíîâ 121 ï.í., à ñ ïðàéìåðàìè CDC1 è CDC2 – 440 ï.í. Ïîëó÷åííûå ðåçóëüòàòû äîêóìåíòèðóþò ôîòîãðàôèðîâàíèåì èëè ñ ïîìîùüþ êîìïüþòåðíîé âèäèîñèñòåìû.
4.2.6. Ïî îêîí÷àíèþ ðàáîòû åìêîñòè ñ îòðàáîòàííûì ìàòåðèàëîì ïîìåùàþò â áàê äëÿ àâòîêëàâèðîâàíèÿ.  áîêñå è êîìíàòàõ ïðîâîäÿò òåêóùóþ äåçèíôåêöèþ.

6. Ðåæèìû îáåççàðàæèâàíèÿ ðàçëè÷íûõ îáúåêòîâ ïðè ëàáîðàòîðíîé äèàãíîñòèêå SARS (â ñîîòâåòñòâèè ñ ÑÏ 1.2.011-94)

6.1. Îáåççàðàæèâàíèå ïîâåðõíîñòåé ïîìåùåíèÿ (ïîë, ñòåíû, äâåðè), îáîðóäîâàíèÿ, ðàáî÷èõ ñòîëîâ è äð. — äâóêðàòíûì ïðîòèðàíèåì ñ èíòåðâàëîì 15 ìèí 6% ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà èëè 3% ðàñòâîðîì õëîðàìèíà (ýêñïîçèöèÿ 120 ìèí) ñ ïîñëåäóþùåé îáðàáîòêîé ÓÔ â òå÷åíèå 60 ìèí.
6.2. Îáåççàðàæèâàíèå çàùèòíîé îäåæäû îñóùåñòâëÿþò:
à) êèïÿ÷åíèåì â 2% ðàñòâîðå ñîäû â òå÷åíèå 30 ìèí ñ ìîìåíòà çàêèïàíèÿ;
á) çàìà÷èâàíèåì íà 30 ìèí ïðè 50° Ñ â 3% ðàñòâîðå ïåðåêèñè âîäîðîäà ñ 0,5% ìîþùåãî ñðåäñòâà.
â) ïðè èñïîëüçîâàíèè ÊÇÌ – ïðîòèðàíèåì 6% ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà ñ 0,5% ìîþùåãî ñðåäñòâà èëè îðîøåíèåì 3% ðàñòâîðîì õëîðàìèíà.
6.3. Îáåççàðàæèâàíèå ïåð÷àòîê — çàìà÷èâàíèåì íà 60 ìèí â 6% ðàñòâîðå ïåðåêèñè âîäîðîäà ñ 0,5% ìîþùåãî ñðåäñòâà èëè â 3% ðàñòâîðå õëîðàìèíà.
6.4. Îáåççàðàæèâàíèå çàùèòíûõ î÷êîâ — äâóêðàòíûì ïðîòèðàíèåì 6% ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà ñ èíòåðâàëîì 15 ìèí, ñ ïîñëåäóþùèì îáìûâàíèåì âîäîé
6.5. Îáåççàðàæèâàíèå ëàáîðàòîðíîé ïîñóäû, àâòîêëàâèðóåìûõ äîçàòîðîâ, íàêîíå÷íèêîâ, âèðóññîäåðæàùèõ æèäêîñòåé, àãàðîçíîãî ãåëÿ, èíñòðóìåíòàðèÿ èç ìåòàëëà ïðîâîäèòñÿ ìåòîäîì àâòîêëàâèðîâàíèÿ — äàâëåíèå 2,0 êÃñ/ñì2 (0,2 ÌÏà), òåìïåðàòóðà 132±2° Ñ, âðåìÿ 45 ìèí.
6.6. Îáåççàðàæèâàíèå äîçàòîðîâ — äâóêðàòíûì ïðîòèðàíèåì ñ èíòåðâàëîì 15 ìèí 6% ðàñòâîðîì ïåðåêèñè âîäîðîäà, ñ ïîñëåäóþùåé îáðàáîòêîé ÓÔ â òå÷åíèå 60 ìèí.

Ïîëó÷åííûé ìåòîäîì ÏÖÐ ïîëîæèòåëüíûé ðåçóëüòàò ñ îäíîé èëè ñ äâóìÿ ïàðàìè ïðàéìåðîâ íå ÿâëÿåòñÿ áåçóñëîâíûì äîêàçàòåëüñòâîì íàëè÷èÿ âèðóñà SARS, à ïðîáà îò äàííîãî áîëüíîãî ïîäëåæèò íàïðàâëåíèþ â ñïåöèàëèçèðîâàííûé öåíòð äëÿ ïðîâåäåíèÿ ïîäòâåðæäàþùåãî àíàëèçà.