Окраска мазка по граму при пневмонии
загрузка…
Поскольку ни клинические, ни рентгеноскопические исследования не дают возможности установить специфическую этиологию большинства видов пневмонии, для клиницистов имеют большое значение другие методы лабораторного обследования. Наиболее полезными из лабораторных анализов являются: посевы крови, мокроты и плевральной жидкости, окраска мокроты по Граму. Действительно, положительный результат посева крови или плевральной жидкости остается определяющим методом идентификации этиологического агента, если только не может быть получена для посева ткань легкого. К сожалению, посевы крови дают положительный ответ приблизительно лишь в одной четверти случаев пневмонии, кроме тех инфекций легкого, которые имеют метастатический характер и вторичны по отношению к бактериемии из других органов.
Мазок мокроты весьма информативен, если на нем обнаружено много клеток, принимающих участие в воспалительном процессе (особенно ПМЯЛ), и однотипная микрофлора, например грамположительные кокки или грамотрицательные палочки. Результат особенно показателен, если микроорганизмы находятся внутри или около ПМЯЛ.
Посев мокроты сам по себе менее информативен, чем окраска мазка по Граму, по нескольким причинам: анаэробные кокки, палочки, пневмококки, стафилококки, стрептококки, Haemophilus и Branhamella могут являться частью нормальной микрофлоры, высеваемой из носоглотки. Кроме того, грамотрицательные палочки нередко не обнаруживаются в верхних дыхательных путях даже тяжелых стационарных больных. Таким образом, положительный результат посева мокроты без одновременной окраски по Граму, выявляющей присутствие в мазках ПМЯЛ, легочных макрофагов и доминирующего типа бактериальной микрофлоры, мало способствует установлению диагноза. Кроме того, довольно часто вообще не удается выявить пневмококки в посевах мокроты больных пневмококковой пневмонией, подтвержденной положительными результатами высевов из крови. Это показывает опасность ориентации только на результаты посевов мокроты без окраски мазков по Граму.
Между тем при окраске мокроты по Граму встречаются свои сложности. Прежде всего необходимо быть уверенным, что вы имеете дело с мокротой, а не со слюной. Лучшее доказательство того, что изучаемый образец действительно мокрота,— присутствие в нем альвеолярных макрофагов. Образцы материала с большим количеством эпителиальных клеток не следует брать для анализа, так как они происходят из верхних дыхательных путей. Качество окраски контролируется по цвету ядер ПМЯЛ, который должен быть бледно-сиреневым, а не синим. Чтобы проверить, правильно ли произошло обесцвечивание, можно сделать параллельный контроль с известными грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами. При проведении окраски по Граму хорошим контролем может служить анализ взятого у врача (здорового человека) образца зубного налета, который должен содержать как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии.
Итак, особенно внимательному изучению на предмет выявления возбудителя следует подвергнуть поля мазка с многочисленными ПМЯЛ. При активной инфекции иногда видны ПМЯЛ, содержащие фагоцитированные бактерии. Если внутрилейкоцитов обнаруживается присутствие большого количества грамположительных кокков, то более вероятно, что это стафилококки, а не пневмококки, так как:
1) пневмококки — обычно хорошо инкапсулированные бактерии — с большим трудом фагоцитируются на ранней стадии инфекции (до выработки специфических антител);
2) будучи фагоцитированы, пневмококки быстро уничтожаются. Обнаружение в мазках, окрашенных по Граму, многочисленных ПМЯЛ и смешанной микрофлоры с множеством плеоморфных грамотрицательных палочек, которые не растут в аэробных условиях, служит наиболее значимым критерием при постановке диагноза анаэробной пневмонии. Присутствие большого количества лейкоцитов при одновременной скудости бактериальной микрофлоры свидетельствует в пользу либо небактериального процесса, либо бактериальной инфекции, возбудители которой не выявляются при окраске по Граму. В последнем случае следует прежде всего подозревать микоплазмоз или легионеллез, хотя нельзя исключать и другую этиологию, в частности туберкулез, вирусную пневмонию, лихорадку Ку, орнитоз и хламидиоз.
В последнее время в диагностику пневмонии по анализам мокроты активно внедряются молекулярно-биологические методы, такие как ДНК-зонды или полимеразная цепная реакция. Круг возбудителей, определяемых этими методами, постоянно расширяется и включает патогенные грибы, микобактерии, бактерии и вирусы, однако их применимость зависит в первую очередь от их доступности и стоимости.
Хотя микроскопическое исследование мокроты является очень полезным неинвазивным методом, который позволяет сделать предположение о природе этиологического агента, может возникнуть необходимость в других диагностических процедурах. В случаях, когда пациент неспособен сам отхаркивать мокроту, применяется транстрахеальная вытяжка, которая также дает возможность избавиться от загрязнения образца микрофлорой носоглотки. Бронхоскопия и назофаринге-альная аспирация позволяют опуститься ниже обычно стерильного киля трахеи и менее инвазивны, чем транстрахеальная аспирация, но фарингеальное загрязнение в этом случае неизбежно.
В заключение следует сделать несколько замечаний по поводу лечения пневмонии. Обычно антимикробная терапия пневмонии основывается на этиологии заболевания, установленной с помощью окраски мазков по Граму, но иногда лечение необходимо начать при отсутствии мазков мокроты и до проведения других лабораторных исследований. В таких случаях лечение следует назначать, имея в виду наиболее вероятную этиологию. Например, у студента колледжа с локализованным инфильтратом, непродуктивным кашлем и лихорадкой, который не выглядит тяжелобольным, следует подозревать прежде всего микоплазменную пневмонию. Хотя не стоит исключать при таких симптомах и возможности вирусной или пневмококковой этиологии заболевания. В этом случае для лечения может быть применен эритромицин, эффективный как в отношении микоплазмы, так и пневмококков. Если же болезнь протекает тяжело, с острой лихорадкой , гипоксией и множественными инфильтратами, совершенно необходимо получить мокроту для окраски по Граму. Если и это не даст определенных результатов, то первоначальный спектр антибиотиков следует расширить путем назначения препаратов эффективных не только против пневмококков, но и против стафилококков, грамотрицательных палочек, анаэробов и, возможно, легионелл. Для дополнительных диагностических заключений следует принять во внимание возраст больного, его иммунный статус и возможные контакты с определенными возбудителями.
загрузка…
Источник
Поскольку ни клинические, ни рентгеноскопические исследования не дают возможности установить специфическую этиологию большинства видов пневмонии, для клиницистов имеют большое значение другие методы лабораторного обследования. Наиболее полезными из лабораторных анализов являются: посевы крови, мокроты и плевральной жидкости, окраска мокроты по Граму. Действительно, положительный результат посева крови или плевральной жидкости остается определяющим методом идентификации этиологического агента, если только не может быть получена для посева ткань легкого. К сожалению, посевы крови дают положительный ответ приблизительно лишь в одной четверти случаев пневмонии, кроме тех инфекций легкого, которые имеют метастатический характер и вторичны по отношению к бактериемии из других органов.
Мазок мокроты весьма информативен, если на нем обнаружено много клеток, принимающих участие в воспалительном процессе (особенно ПМЯЛ), и однотипная микрофлора, например грамположительные кокки или грамотрицательные палочки. Результат особенно показателен, если микроорганизмы находятся внутри или около ПМЯЛ.
Посев мокроты сам по себе менее информативен, чем окраска мазка по Граму, по нескольким причинам: анаэробные кокки, палочки, пневмококки, стафилококки, стрептококки, Haemophilus и Branhamella могут являться частью нормальной микрофлоры, высеваемой из носоглотки. Кроме того, грамотрицательные палочки нередко не обнаруживаются в верхних дыхательных путях даже тяжелых стационарных больных. Таким образом, положительный результат посева мокроты без одновременной окраски по Граму, выявляющей присутствие в мазках ПМЯЛ, легочных макрофагов и доминирующего типа бактериальной микрофлоры, мало способствует установлению диагноза. Кроме того, довольно часто вообще не удается выявить пневмококки в посевах мокроты больных пневмококковой пневмонией, подтвержденной положительными результатами высевов из крови. Это показывает опасность ориентации только на результаты посевов мокроты без окраски мазков по Граму.
Между тем при окраске мокроты по Граму встречаются свои сложности. Прежде всего необходимо быть уверенным, что вы имеете дело с мокротой, а не со слюной. Лучшее доказательство того, что изучаемый образец действительно мокрота,— присутствие в нем альвеолярных макрофагов. Образцы материала с большим количеством эпителиальных клеток не следует брать для анализа, так как они происходят из верхних дыхательных путей. Качество окраски контролируется по цвету ядер ПМЯЛ, который должен быть бледно-сиреневым, а не синим. Чтобы проверить, правильно ли произошло обесцвечивание, можно сделать параллельный контроль с известными грамотрицательными и грамположительными микроорганизмами. При проведении окраски по Граму хорошим контролем может служить анализ взятого у врача (здорового человека) образца зубного налета, который должен содержать как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии.
Итак, особенно внимательному изучению на предмет выявления возбудителя следует подвергнуть поля мазка с многочисленными ПМЯЛ. При активной инфекции иногда видны ПМЯЛ, содержащие фагоцитированные бактерии. Если внутрилейкоцитов обнаруживается присутствие большого количества грамположительных кокков, то более вероятно, что это стафилококки, а не пневмококки, так как:
1) пневмококки — обычно хорошо инкапсулированные бактерии — с большим трудом фагоцитируются на ранней стадии инфекции (до выработки специфических антител);
2) будучи фагоцитированы, пневмококки быстро уничтожаются. Обнаружение в мазках, окрашенных по Граму, многочисленных ПМЯЛ и смешанной микрофлоры с множеством плеоморфных грамотрицательных палочек, которые не растут в аэробных условиях, служит наиболее значимым критерием при постановке диагноза анаэробной пневмонии. Присутствие большого количества лейкоцитов при одновременной скудости бактериальной микрофлоры свидетельствует в пользу либо небактериального процесса, либо бактериальной инфекции, возбудители которой не выявляются при окраске по Граму. В последнем случае следует прежде всего подозревать микоплазмоз или легионеллез, хотя нельзя исключать и другую этиологию, в частности туберкулез, вирусную пневмонию, лихорадку Ку, орнитоз и хламидиоз.
В последнее время в диагностику пневмонии по анализам мокроты активно внедряются молекулярно-биологические методы, такие как ДНК-зонды или полимеразная цепная реакция. Круг возбудителей, определяемых этими методами, постоянно расширяется и включает патогенные грибы, микобактерии, бактерии и вирусы, однако их применимость зависит в первую очередь от их доступности и стоимости.
Хотя микроскопическое исследование мокроты является очень полезным неинвазивным методом, который позволяет сделать предположение о природе этиологического агента, может возникнуть необходимость в других диагностических процедурах. В случаях, когда пациент неспособен сам отхаркивать мокроту, применяется транстрахеальная вытяжка, которая также дает возможность избавиться от загрязнения образца микрофлорой носоглотки. Бронхоскопия и назофаринге-альная аспирация позволяют опуститься ниже обычно стерильного киля трахеи и менее инвазивны, чем транстрахеальная аспирация, но фарингеальное загрязнение в этом случае неизбежно.
В заключение следует сделать несколько замечаний по поводу лечения пневмонии. Обычно антимикробная терапия пневмонии основывается на этиологии заболевания, установленной с помощью окраски мазков по Граму, но иногда лечение необходимо начать при отсутствии мазков мокроты и до проведения других лабораторных исследований. В таких случаях лечение следует назначать, имея в виду наиболее вероятную этиологию. Например, у студента колледжа с локализованным инфильтратом, непродуктивным кашлем и лихорадкой, который не выглядит тяжелобольным, следует подозревать прежде всего микоплазменную пневмонию. Хотя не стоит исключать при таких симптомах и возможности вирусной или пневмококковой этиологии заболевания. В этом случае для лечения может быть применен эритромицин, эффективный как в отношении микоплазмы, так и пневмококков. Если же болезнь протекает тяжело, с острой лихорадкой , гипоксией и множественными инфильтратами, совершенно необходимо получить мокроту для окраски по Граму. Если и это не даст определенных результатов, то первоначальный спектр антибиотиков следует расширить путем назначения препаратов эффективных не только против пневмококков, но и против стафилококков, грамотрицательных палочек, анаэробов и, возможно, легионелл. Для дополнительных диагностических заключений следует принять во внимание возраст больного, его иммунный статус и возможные контакты с определенными возбудителями.
— Читать далее «Вирусная пневмония. Эпидемиологические критерии пневмонии.»
Оглавление темы «Лихорадка и пневмонии.»:
1. Лихорадки. Повышение температуры тела.
2. Лихорадка у амбулаторных больных. Причины и виды лихорадки в поликлинике.
3. Лихорадки у госпитальных больных. Острые пневмонии.
4. Главные причины пневмоний. Микоплазменная пневмония. Бактериальная пневмония.
5. Пневмококковая пневмония. Стафилококковая пневмония.
6. Пневмония, вызванная клебсиеллой. Пневмония, вызванная анаэробными микроорганизмами.
7. Виды пневмоний. Характеристика редких форм пневмоний.
8. Лабораторная диагностика бактериальных пневмоний. Методы диагностики пневмонии.
9. Вирусная пневмония. Эпидемиологические критерии пневмонии.
10. Пневмония как осложнение при нарушении иммунного статуса. Роль нарушения иммунного статуса.
Источник
Данный метод окраски является базовым в микробиологии, т.к. на его основе бактерии классифицируются на две большие группы – грамположительные и грамотрицательные. Основой данного подразделения бактерий является их отношение к даннной окраске. Изначально бактерии не имеют цвета, т.е. прозрачны. Но за счет различного строения своих оболочек они по-разному воспринимают тот или иной краситель. И данное свойство воспринимать окраску – строго врожденное, видовое и практически неизменное. Поэтому такое свойсво бактерий (свойство восприятия краски) и легло в основу их классификации. Деление бактерий на грамположительных и грамотрицательных можно встретить, например, в любой инструкции к антибиотикам.
При классической окраске по Граму чаще применяются такие компоненты: карболовый раствор генцианового фиолетового, карболовый раствор фуксина, раствор Люголя, спирт этиловый. Концентрированный карболовый фуксин называется еще фуксин Циля, разведенный водой – фуксин Пфейфера. Все наименования компонентов по фамилиям ученых (как и собственно само название метода: по Граму).
Методика проведения окрашивания.
Предметное стекло перед исследованием обезжиривают и делают на нем мазки исследуемых культур. Мазки следует делать тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись на поверхности стекла и не образовывали скоплений. Препарат высушивают при температуре 20-22 0C, фиксируют над пламенем горелки (спиртовки).
1. На фиксированный мазок нанести раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин.
2. Не промывая водой, нанести на препарат раствор Люголя и выдержать 1 мин — до полного почернения мазка.
3. Раствор Люголя слить и обесцветить мазок 70% спиртом этиловым, несколько раз наливая его на предметное стекло и покачивая стекло. Процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости (но не более 30 сек.).
4. Препарат промыть водой.
5. На препарат нанести на 1-2 мин раствор карболового фуксина, разведенного 1:9 водой (фуксин Пфейфера).
6. Краску слить, препарат промыть водой, осушить фильтрованной бумагой или высушить на воздухе, и микроскопировать с иммерсионной системой.
Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные — в красный. Поэтому основополагающим здесь является результат окраски – цвет. По инструкции все бактерии красятся одними и теми же красителями, а в итоге получается разный цвет. Почему? Все заключается в строении клеточной стенки. У одних бактерий она толстая, и поэтому глубоко прокрашивается фиолетовым красителем, не воспринимая уже последующий краситель. Это будут грамположительные бактерии. А у других клеточная стенка тонкая. Первым красителем она так же окрашивается, но потом вымывается спиртом и докрашивается вторым красителем.
Набор для классической окраски по Граму
Если схематично описать метод, то происходит следующее:
— окраска бактерий в фиолетовый цвет (генциановым фиолетовым) – все бактрии становятся фиолетовыми;
— прочная связь красителя в толще оболочки с молекулами йода (при добавлении раствора Люголя) – мазок приобретает бурый цвет;
— обесцвечивание тонкостенных бактерий этиловым спиртом (вымывание красителя из оболочки) – толстостенные бактерии остаются фиолетовыми, тонкостенные становятся бесцветными;
— докрашивание в красный цвет — толстостенные бактерии остаются фиолетовыми, тонкостенные перекрашиваются в красный цвет.
Грамположительные кокковые колонии. Увеличение 1000х.
Помимо классической методики существует и множество модификаций: модификация по Эткинсу, по Калине, по Синеву, по Николля и др. Суть практически везде сохраняется, но немного изменена сама методика окрашивания, либо заменены красители на другие. Например, фуксин часто заменяется на 2% раствор сафранина. Это вносит определенное удобство в работу, т.к. разведенный водой фуксин (фуксин Пфейфера) не очень стоек (хранится 1-2 суток), и приходится каждый раз готовить свежий раствор, а раствор сафранина не требует разведения и используется без подготовки.
Примечательна методика окраски по Граму в модификации по Синеву. Специфика окраски заключается в том, что вместо растворов красителей используются кусочки фильтровальной бумаги, которые заранее пропитываются данными расворами и высушиваются. Окраска происходит при наложении сухой окрашенной бумажки на мазок и нанесении капли воды на бумажку. Бумага мгновенно пропитывается и краситель вымывается на мазок.
Набор для окраски по Граму в модификации по Синеву
Какие возможные ошибки бывают при окраске по Граму и как с ними не столкнуться?
Чаще это ошибки технического характера.
1. Все бактерии в итоге грамположительные. Такое действительно бывает, когда, например, в мазок попали колонии стрептококков, стафилококков и др. (они по природе практически все грамположительные). Но если рассматривать с позиции ошибки, то это случается, когда мазок недостаточно контактировал со спиртом, т.е. не обесцветились тонкостенные бактерии. В итоге все остались фиолетовыми.
2. Все бактерии в итоге грамотрицательные. Если опять отмести возможность присутствия только действительно грамотрицательных бактерий, то ошибка заключается в обратном. Т.е. в переобесцвечивании спиртом. В итоге все обесцвечиваются, и все перекрашиваются в красный цвет. Поэтому при нанесении спирта очень важно соблюдать время контакта с мазком.
3. Отсутствие бактерий в мазке. Это из-за неправильного забора материала, или неправильной фиксации материала (все бактерии смываются при первой же отмывке).
4. Мазок не побурел при нанесении раствора Люголя. Причина – испорченный раствор. Раствор Люголя предпочтительно хранить в стеклянной емкости, из пластиковой емкости со временем йод улетучивается, а сам раствор становится светло-коричневым. Как итог – все бакетрии могут получиться грамотрицательными.
5. Большие фиолетовые образования правильной круглой формы, видимые в микроскоп. Это не кокки — это несмытые капельки генцианового фиолетового после некачественной промывки спиртом.
6. Бактерии в виде объемных нагромождений. Причина в недостаточном распределении бактерий по стеклу на начальном этапе. Мазок нужно равномерно распределять тонким слоем.
7. Другие ошибки. Это может быть несоблюдение времени окраски (недокрашивание, перекрашивание), несоответствие концентрации спирта, чрезмерная тепловая фиксация мазка и т.п.
Небольшие хитрости в вопросах-ответах.
Можно ли использовать аптечный раствор Люголя? Нет! Он другого состава.
Можно ли использовать аптечный этиловый спирт? Да. Но главное чтобы был без добавок типа хлоргексидина, муравьиной кислоты и т.п.
А водку вместо спирта? Нет, в ней недостаточная концентрация спирта, надо 70%.
Можно ли заменить этиловый спирт на изопропиловый? При необходимости можно. Но немного сократить время контакта с мазком.
Можно ли использовать химическую фиксацию вместо тепловой? Да, но это немного сложнее. (Об этом в другой статье).
Как использовать мазок многократно? Очень удачный препарат можно еще несколько раз в дальнейшем просматривать, не смотря на то, что на мазке находится иммерсионное масло. Удалить его никак не получится. Но можно стекло с мазком защитить от пыли помещением в футляр. А в дальнейшем наносить новую каплю масла и вновь микроскопировать.
Подводя итог сказанному, главное – придерживаться методики. Методика сама по себе не строгая, но ошибки на начальных этапах случаются. После нескольких окрашиваний всегда можно понять недочеты и в дальнейшем их легко предотвращать, получая очень красивые и качественные результаты.
Источник
